Translate

domingo, 27 de janeiro de 2013

Prática 002/2013 - Fracionamento celular – separação de organelas e macromoléculas


1. INTRODUÇÃO
As células podem ser rompidas de várias maneiras; por exemplo, por intermédio de choque osmótico, pelo uso de vibrações ultra-sônicas e por métodos mecânicos quando são forçadas a passar por um pequeno orifício ou são homogeneizadas. A aplicação cuidadosa desses procedimentos permite que organelas como núcleo, mitocôndrias, complexo de Golgi e Peroxissomos fiquem intactas e também muitas vesículas derivadas do retículo endoplasmático, chamadas microssomos, mantenham muito de suas propriedades bioquímicas originais.

2. OBJETIVO
Separar os componentes celulares através do fracionamento por centrifugação para o estudo da organização molecular e do funcionamento da célula.

3. MATERIAL
02 a 03 Folhas de Tradescantia purpurea (manto-de-viúva ou trapoeraba);


Figura 1: Detalhe da flor de Tradescantia purpurea conhecida vulgarmente como manto-de-viúva ou trapoeraba (Foto: Guilherme Araújo Lacerda).

01 Amofariz (gral) e 01 pistilo (ou pires e colher);
02 a 04 tubos de microcentrífuga;
01 Microscópio óptico;
02 Pipetas Pasteur ou conta-gotas;
01 Minicentrífuga (ver prática 001/2013);
05 mL de detergente de louça (líquido ou gel);
100 mL de Água acidulada (2 a 3 gotas de vinagre – ou ácido acético – em mais ou menos 100 mL de água).

4. MÉTODOS
1)    Coloque 3 mL de água acidulada em um almofariz (ou um pires). A razão para usar água acidulada é porque o pigmento antocianina que iremos separar dos cloroplastos é rosa ou roxo em pH ácido, mas verde em pH alcalino. Como iremos separar a antocianina da clorofila, que também é verde, ficará difícil de notar a diferença dos dois pigmentos se por ventura a água de sua torneira for levemente alcalina.
2)    Esmague nessa solução 2 a 3 folhas de Tradescantia com um pistilo (ou uma colher);
3)    Transfira com uma pipeta de Pasteur a parte líquida do homogeneizado para um tubo de minicentrífuga e centrifugue rapidamente (15 seg) para retirar fibras de celulose e outros resíduos maiores;


4)    Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Observe que o líquido tem cor marrom. Centrifugue por 5 minutos; Pode-se ver claramente, após a centrifugação, que o sobrenadante é um líquido roxo, pela presença do pigmento hidrossolúvel antocianina. No fundo do tubo fica um precipitado verde, pela presença dos cloroplastos, que são organelas grandes e por isso vão para o fundo do tubo.




5)    Transfira o sobrenadante para um novo tubo;


6)    Com a pipeta Pasteur, ressuspenda o precipitado (cloroplastos) em água acidulada. Sugira aos alunos que descrevam e desenhem o que acontece;


7)    Acrescente uma gota de detergente no tubo contendo a solução “verde” e agite o tubo por mais ou menos um minuto;
8)    Centrifugue por cinco minutos os tubos com o sobrenadante (“solução roxa”) e com o precipitado (“solução verde”).
9)    Observe e descreva o que aconteceu com o material contido nos tubos. Note que agora os cloroplastos não precipitam mais, uma vez que deixaram de existir, pois o detergente “desmanchou” as membranas daquela organela. O líquido do tubo fica “todo verde”, porque ao destruir os cloroplastos o detergente “libera” a clorofila. Como esta é uma pequena molécula, a força centrífuga aplicada não consegue precipitá-la, como também não precipita a antocianina, que também é uma molécula pequena.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
LORETO, E.L.S.; SEPEL, L.M.N. Atividades experimentais e didáticas em biologia molecular e celular. 2ª Ed. São Paulo: Sociedade Brasileira de Genética, 2003. p.27-29.

2 comentários:

  1. Trabalho muito bom pela simplicidade do material e pela riqueza de conteudo que é capaz de apresentar. Parabéns!
    Profa. Jandyra MB Pires
    Universidade Veiga de Almeida.

    ResponderExcluir
  2. Existe outro método de fracionamento celular que não seja por centrifugação?

    ResponderExcluir